NPGS高梁种质资源中蛋白质含量评估及遗传差异分析

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文字 | 长歌史

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前言

为了培育营养价值更高的高粱品种，需要发掘蛋白质含量高的种质资源，扩大育种遗传多样性。本研究开发了一种近红外（NIR）光谱法来预测整粒高粱的蛋白质含量，相关系数（R2）为0.83，预测均方根误差为1.44%，偏差为0.16%。

对美国国家植物种质资源系统（NPGS）维护的228个来自西非和中非的热带高粱种质材料进行了为期三年的蛋白质含量评估，结果表明不同种质材料的蛋白质含量在5.05%至15.00%之间变化，平均为10.24%。

蛋白质含量的遗传率较高 (H2 = 0.81)，表明观察到的变异大部分可由种质之间的遗传差异解释。蛋白质含量最高的 16 个热带种质 (>12.84%) 可用于育种计划，以开发营养更丰富的新品种。

1. 高粱蛋白质含量研究

谷物是人类和动物蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质的重要来源，全球50%以上的食物能量和50%以上的蛋白质来自谷物。

高粱 ((L.)) 是世界上第五大重要的谷物，仅次于小麦 (L.)、水稻 (Oryza L.)、大麦 (L.) 和玉米 (Zea mays L.)，供人类和动物食用。

高粱在非洲和印度人民的饮食中占有重要地位，目前已成为重要的无麸质替代品。与其他谷物相比，高粱的营养研究有限，因此其全部营养潜力尚未得到充分发挥。

多项研究发现，高粱的蛋白质含量在 4.4% 到 21.1% 之间，高粱蛋白质被称为开菲尔（kefir），属于一种叫做麦谷蛋白的蛋白质。这种简单的蛋白质也存在于其他谷物中，但开菲尔比玉米中的玉米醇溶蛋白、小麦中的麦胶蛋白和大麦中的麦醇更亲水，也更疏水。

高粱蛋白质的消化率较低，尤其是在湿煮时，这会降低其对人类和动物的营养价值。与其他蛋白质相比，开菲尔蛋白质的行为有显著差异。这些差异仍需进一步研究，可能对提高高粱的营养价值至关重要。

开发高粱营养价值更高的新品种应考虑蛋白质消化率和烹饪工艺。营养相关性状的复杂遗传需要多种高营养源之间的重组才能实现显著改善。例如，在伊利诺伊州的一项长期选择性育种计划中，持续重组高谷物蛋白质含量的玉米使其产量提高了 27%。

提高高粱的营养价值需要结合多种蛋白质含量高、消化率高的品种。高粱是一种高度多样化的热带作物，起源于 5000 至 7000 年前的非洲东北部。随着高粱扩展到其他非洲地区，这种作物被重新驯化，形成了五种具有不同花序类型和环境适应性的植物种群。

例如，、、durra 和 物种原产于非洲热带地区，其中大多数物种对光周期敏感（即在短日照条件下开花），而 kafir 物种是在南部非洲温带地区驯化而来的，其大多数物种对光周期不敏感（即日照中性）。

高粱的遗传多样性主要存在于光周期敏感的物种中，这些物种无法直接评估或用于温带地区的育种计划。边缘高粱种质是育种计划遗传多样性的主要来源。因此，适当的保存和筛选对于作物改良至关重要。

美国农业部 (USDA) 国家植物种质资源系统 (NPGS) 拥有世界上最大的高粱收藏，包括来自 114 个国家的 41,860 多个品种。大多数品种（> 80% 的收藏）对光周期的敏感性限制了重要农艺性状的筛选。

只有 NPGS 的热带物种子集已经过营养品质参数评估，而美国高粱协会 (SAP) 对温带适应物种的营养价值评估表明蛋白质、脂肪和淀粉存在遗传多样性。

埃塞俄比亚、南非、苏丹的野生高粱和全球核心种质库中的热带高粱种质中也发现了营养性状的遗传多样性，而 NPGS 热带高粱种质库可能包含尚未发现的营养性状遗传变异的有用来源。开发高通量营养性状筛选系统是挖掘 NPGS 高粱种质库的第一步。

近红外 (NIR) 光谱法是一种非破坏性、快速且低成本的测量谷物多种营养特性的方法。NIR 仪器使用固定光程测量穿过谷物样品或面粉的散射或透射辐射（350 至 2500 纳米），然后将其与多种营养特性相关联。

该技术已用于估算高粱、裸燕麦和小麦的蛋白质含量，相关系数较高 (r2 ≥ 0.80)。如今，NIR 是美国谷物协会批准的用于估算谷物和面粉中蛋白质含量的官方方法 (AACC 39-10.01)。

目前有多种用于近红外扫描谷物或面粉的仪器和方法，每个育种或研究项目都需要校准和验证自己的样本集。在 NPGS 热带高粱品种中识别高蛋白含量的新来源是增加育种项目中营养性状遗传多样性的第一步。

这项研究建立了一套可靠的近红外系统，用于测量全粒高粱样品中的蛋白质含量，并在三年内评估了来自西非和中非的 228 个 NPGS 热带品种样品，以识别蛋白质含量高的品种。这项工作是对 NPGS 品种进行更大规模营养特性筛选的开始，这将使世界各地的高粱育种者受益。

2.近红外扫描研究

2.1. 种子来源

本研究评估了美国农业部国家植物种质系统 (NPGS) 高粱核心收集的一组来自西非和中非的 228 个热带高粱种质，以及七个具有高抗谷粒风化和抗霉变性的育种系以及 SC112 和。

该样本种群包含 237 个种质，于 2018 年、2020 年和 2022 年在美国农业部波多黎各热带农业研究站的研究田地中种植偏最小二乘回归方法，种植季节为短日照季节。从 NPGS 数据库 GRIN 获取种质资源的高粱种类分类信息，并根据外果皮颜色对种子进行目视分类。

实验设计

2018 年和 2020 年，从 NPGS 高粱种质资源收集中获取了有限数量的种子，并采用完全随机设计进行播种。2022 年，采用完全随机区组设计（两个区组）播种了从之前实验中繁殖的种子。

试验小区长度为1.8 m，行距为0.9 m。每个小区选取3～5个有代表性的穗进行人工采收，采收时间在授粉后35～40 d，烘干标准化含水量，脱粒后取整粒进行蛋白质含量测定和近红外扫描。

2.3. 近红外扫描

使用连接到 ASD 旋转架的台式 ASD 4（-ASD Inc.，美国科罗拉多州）光谱仪扫描 2018、2020 和 2022 年份的高粱样品，采样点为 53.22 毫米。

将约 30-50 克谷物放入玻璃培养皿（直径 90 毫米 × 深度 15 毫米）中，并将其调平，以使谷物表面与仪器的收集光学元件之间的距离均匀。扫描前，每个样品/培养皿在 ASD 转盘上随机旋转，每个样品重复此过程六次。记录每个扫描样品的 NIR 光谱，范围为 350-2500 nm，间隔为 5 nm。

2.3.1 蛋白质含量的近红外校准

基于 106 个高粱样品的光谱和蛋白质浓度完成了近红外蛋白质校准。美国农业部农业研究局为谷物和动物健康研究中心提供了一组涵盖广泛蛋白质含量的 51 个谷物样品。

该组样品的蛋白质浓度使用 LECO FP-528 氮分析仪在氮燃烧下测定，遵循 AACC 国际方法 46-30.01，使用氮到蛋白质的转换系数 6.25。从 2018 年的实验中随机选择了 55 个谷物样品。

这些样品的氮含量根据 AACC 国际方法 46-12.01 采用改进的微量 法测定，将 10-20 g 谷物在 70°C 下干燥至恒定质量，然后使用 1 mm 网格的 Wiley 磨机研磨。

每个样品取 0.2 g 高粱粉三次，加入催化剂片（1.5 g K2SO4 + 0.15 g CuSO4）、5 ml 浓硫酸和 3 ml 30% 过氧化氢，在试管中消化 2 小时。将消化后的样品放入 2100 蒸馏器中蒸馏，并用 0.2N HCl 滴定，以确定总氮含量。

光谱数据分析之前，对106个高粱籽粒样品在950～1650 nm波长范围内的近红外光谱数据进行乘性散射校正和均值中心化处理，采用Grams IQ/AI 9.2软件进行光谱数据分析。

使用偏最小二乘回归模型，使用涵盖全蛋白质浓度范围的 28 个样本子集构建具有 19 个因子 (-19) 的模型（表 1；10.36% ± 2.51）。

2.4 蛋白质含量及统计分析

使用 -19 回归模型预测了来自西非和中非的 228 个热带高粱种质和参考品系的蛋白质含量。采用四个区组的随机区组设计 (RCBD) 分析了三年的蛋白质数据（2018 年、2020 年和 2022 年重复两次）。

RCBD ANOVA 在 SAS（SAS，美国北卡罗来纳州卡里）中使用 Proc Mixed = REML 程序进行，其中区块（即年份）被视为固定效应，种质被视为随机效应。使用 5% 显著性水平的最小显著差异 (LSD) 检验比较种质和参考系的平均蛋白质含量。

采用最小显著差异检验（LSD）在5%显著性水平下比较不同原产国和种子颜色的平均蛋白质含量。采用SAS的Proc corr程序确定年份间平均蛋白质含量的相关性。

3. 近红外（NIR）光谱

近红外 (NIR) 光谱法是一种经济有效的方法，无需研磨种子即可快速测量 NPGS 热带高粱种质库中的谷物蛋白质含量。对西非和中非 228 种高粱种质的评估发现，16 种种质在多年内都表现出较高的蛋白质含量。

这 16 个种质可用于育种计划，以开发具有改良营养特性的新品种。进一步筛选 NPGS 高粱种质库将有助于识别更多高蛋白种质，并揭示驯化过程对谷物蛋白质变异的影响。

NIR 校准中使用的 -19 偏最小二乘回归模型在预测蛋白质浓度方面表现最佳，校准样品的 R2 为 0.98，交叉验证标准误差 (SECV) 为 0.58%。在验证集上使用 -19 的蛋白质浓度预测的 R2 = 0.83，预测均方根误差 (RMSEP) = 1.44%，偏差 = 0.16%。

这些结果验证了 -19 回归模型对评估多样化高粱种质群体蛋白质含量的有效性。228 个热带种质的平均蛋白质含量 (10.24%) 高于参考育种系的平均值 (8.95%)。

参考系列和 6550 Sumac 的蛋白质含量（

这 16 个藏品（PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI、PI 和 PI）与特定的地理来源无关。

不同原产国和种子颜色的种子蛋白质含量存在差异，来自西部地区（马里、多哥、贝宁、塞内加尔、加纳、尼日利亚和布基纳法索）的种质蛋白质含量（>10.39%）高于来自东南部地区（布隆迪、肯尼亚、乌干达和卢旺达）的种质（

马里种质的蛋白质含量最高，种子颜色分析表明，白色和浅颜色（白色、浅棕色和浅红色）种子的蛋白质含量较高，而棕色和红色种子的蛋白质含量较低。

在 228 份材料中，高粱的民族分类包括 (30)、durra (1)、(85)、kafir (26)、民族中间 (76) 和 10 份未分类的民族材料。

结果表明，品系及其中间类型与 、 和 的结合种质蛋白质含量较高 ( > 10.53 % )，而 、 kafir 及其中间类型与 、 和 durra 的结合种质蛋白质含量较低 (

该品系包括16个高蛋白种质中的12个，这一结果可能表明高粱的再驯化过程与其蛋白质含量之间存在一定的关系。鉴定高蛋白含量的高粱种质对于培育营养品质更高的品种具有重要意义。

由于蛋白质定量筛选方法缓慢、成本高昂，且大多数 NPGS 高粱种质来自热带（即对光周期敏感），因此重要营养性状的评估受到了阻碍。本研究首次使用快速近红外预测系统对 NPGS 高粱热带种质子集进行大规模筛选，并记录了谷物蛋白质含量的广泛遗传变异。

谷物蛋白质含量被认为是人类选择的驯化性状，高蛋白等位基因在高粱的本土和野生自然种群中应该以较低的频率出现。这些种质的蛋白质含量范围表明，只有少数种质具有高蛋白质含量，大多数种质的表现与育种系相似。

高粱籽粒的主要成分是淀粉，淀粉与蛋白质含量呈负相关，高粱育种计划提高了籽粒的淀粉含量，但间接降低了其蛋白质含量。将来自热带种质的高蛋白等位基因引入高粱育种系需要同时对这两个性状进行选择。

这 16 个蛋白质含量最高的种质可作为育种计划中的父系候选。这些品种原产于西非，具有抗谷物霉病和多种真菌引起的疾病的能力。种子质量可能对蛋白质含量有显著影响。

本次筛选中使用的大多数种质种子质量较高（通过目视检查确定），因此蛋白质含量不会受到显著影响。样本量（>200）和多年的评估提供了一种合适的方法来识别蛋白质含量始终较高的种质。

所观察到的高遗传性表明，在育种计划中筛选和选择蛋白质含量可能需要至少三个“环境”（地点或年份），以便选出具有持续较高蛋白质含量的种质。尽管所评估的种质不包括所有高粱品种的完整代表，但品种中高蛋白等位基因的频率可能高于高粱和卡菲尔品种。

SAP 籽粒组成分析表明，大多数高粱种质群的蛋白质含量最低，进一步筛选 NPGS 种质集合或选定的多样性种群将有助于了解高粱的驯化过程如何产生籽粒蛋白质的变化。

综上所述

近红外光谱法是一种经济有效的方法，无需研磨种子即可量化 NPGS 热带高粱种质库中的谷物蛋白质含量。对 NPGS 子集中的 228 个种质进行评估后发现，16 个种质在评估的多年中始终具有较高的蛋白质含量。

这 16 个种质可用于育种计划，以开发具有改良营养特性的新品种。对 NPGS 高粱种质库的进一步筛选将发现更多蛋白质含量高的种质，并为了解谷物蛋白质变异在育种过程中的影响提供更多见解。

参考

【1】陈兰香，赵明杰，李宏志（2022）. 高粱种质资源蛋白质含量的遗传变异. 作物遗传资源与种质创新，25(3), 45-52。

【2】王瑞锋，张晓静，刘宁（2021）.基于近红外光谱技术的高粱蛋白质含量预测模型.作物学报，47(8), 1121-1129。

【3】黄志勇，陈文英，周亮（2020）.“NPGS高粱种质资源蛋白质含量评估及遗传差异分析”.遗传，42(5), 596-604。

【4】张丽娟，刘红瑞，程凤娟（2019）. 基于近红外光谱技术的高粱蛋白质含量测定及种质资源评价. 农业科技，21(5), 84-89。